Le microbiote et la santé

Introduction

Le microbiote est l’ensemble des micro-organismes (bactéries, champignons, archées, virus et parasites) qui résident dans notre corps, et qui peuvent à leur tour être différenciés en commensaux, mutualistes et pathogènes. Le terme microbiome fait référence à l’ensemble de l’habitat, y compris les micro-organismes, leurs gènes et les conditions environnementales, mais dans la pratique, les deux termes sont utilisés de manière interchangeable, confondant le suffixe biome (communauté) avec oma (assemblage). Des écosystèmes microbiens complexes peuvent être trouvés dans chacun des différents endroits de notre organisme. Le plus complexe, le plus diversifié et le plus nombreux est celui associé au tube digestif, notamment au niveau du cæcum, où la densité de micro-organismes est la plus élevée de notre organisme. Ces communautés ont un comportement symbiotique et mutualiste avec les cellules eucaryotes humaines, sont essentielles au bon fonctionnement de notre organisme, entretiennent un dialogue important avec le système immunitaire et ont des fonctions homéostatiques qui conditionnent notre santé. Ces dernières années, de nombreuses preuves scientifiques ont impliqué le microbiome intestinal et son potentiel métabolique dans divers états pathologiques, donnant lieu à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler et réguler cet écosystème. Parmi ces nouvelles approches figure le transfert de microbiote fécal, qui connaît une popularité croissante compte tenu de son succès dans le traitement des diarrhées récurrentes causées par Clostridium difficile.

La connaissance de notre microbiome a été considérablement élargie par l’utilisation de techniques de séquençage moléculaire massif, notamment le séquençage de deuxième génération, également connu sous le nom de séquençage de nouvelle génération. Les cultures microbiologiques ont toujours été utilisées pour déterminer la composition du microbiote, mais on sait aujourd’hui que la plupart des micro-organismes de cet écosystème ne peuvent pas être cultivés avec les milieux traditionnels et ne peuvent être détectés que par séquençage de l’ADN en tant qu’empreinte génétique. L’utilisation de techniques moléculaires a permis d’identifier et d’assigner taxonomiquement la plupart des micro-organismes sans avoir besoin de les cultiver. Cette avancée, ainsi que d’autres techniques microbiologiques qui seront détaillées dans cet article, ont entraîné une véritable révolution dans la connaissance du microbiote et de son implication dans la santé humaine et les états pathologiques.

Considérations cliniques

Dès la naissance, il existe une relation symbiotique entre le microbiote et nos cellules, qui évolue au fil du temps et s’adapte aux changements. En raison de son énorme capacité métabolique, le microbiote a été considéré comme un « organe » essentiel à la vie et ayant une influence sur la santé et la maladie. Sa composition présente des particularités et des caractéristiques propres à chaque individu, et peut varier en fonction du bagage génétique, du régime alimentaire et de l’interaction avec l’environnement.

L’étude de cet écosystème est un domaine en plein essor scientifique, et il est universellement admis que pour atteindre un état de santé adéquat, il est également nécessaire d’avoir un microbiote « sain ». Notre microbiote subit des modifications sous l’influence de multiples facteurs, de manière similaire à celles que connaît tout organe de notre corps, de l’ontogenèse à la mort. Nous sommes continuellement exposés à des facteurs d’influence, bien que l’une de ses caractéristiques soit sa grande capacité de résilience (capacité à s’adapter à un agent perturbateur ou à une situation défavorable, avec récupération ultérieure de l’état initial lorsque l’altération cesse), retrouvant immédiatement son état naturel, ce qui est désigné par le terme « eubiose ». Le niveau de ces changements est défini non seulement par la nature, la force et la durée de la perturbation, mais aussi par la composition et la stabilité de chaque microbiote, en partant du principe que chaque microbiote est unique pour chaque individu. Dans certains cas, la nature de la perturbation est si forte qu’elle entraîne des altérations de sa composition ou de sa fonction, conduisant à un état de dysbiose. La dysbiose peut survenir en quelques jours, notamment après l’ingestion d’antibiotiques, mais elle peut aussi être le résultat d’autres actions à plus long terme, principalement liées à l’alimentation.

Chez une personne adulte, le tractus gastro-intestinal peut abriter entre 500 et 1 000 espèces de micro-organismes, les bactéries des phyla Bacteroidetes (≈25%) et Firmicutes (≈60%) étant majoritaires. Dans des proportions moindres, on détecte des Proteobacteria, Verrucomicrobia, Fusobacteria, Cyanobacteria, Actinobacteria et Spirochaetes, des archées, des champignons, des protozoaires, des virus et d’autres micro-organismes. Il est également important de maintenir des ratios équilibrés, c’est pourquoi le ratio Firmicutes/Bacteroides a été établi comme un paramètre permettant d’évaluer l’équilibre du microbiote intestinal et sa fonctionnalité. Chez les personnes obèses, ce rapport est fortement modifié par une augmentation des Firmicutes. Une augmentation des Firmicutes a également été décrite chez les personnes âgées, de manière physiologique, comme une conséquence de l’âge.

Les principales fonctions du microbiote intestinal sont d’empêcher la colonisation par d’autres micro-organismes pathogènes, de faciliter la digestion des aliments, de produire des vitamines B et K que le corps humain est incapable de synthétiser et, enfin et surtout, de stimuler le système immunitaire. Après la naissance, les cellules du système immunitaire manquent de stimuli, reconnaissant tous les antigènes qui les entourent comme faisant partie de l’organisme et bloquant la réponse inflammatoire à leur encontre. C’est pourquoi les premiers contacts du microbiote avec des lignées de cellules immunitaires indifférenciées sont si importants et permettront de distinguer le « soi » de l' »étranger ». Ce système et le microbiote intestinal entretiennent un dialogue mutualiste continu, mais si cette situation devient déséquilibrée, un processus pathologique peut être initié. Cela semble être la base de certaines maladies auto-immunes où les antigènes du microbiote intestinal représentent un stimulus suffisamment important pour déclencher une réponse inflammatoire. Dans d’autres maladies, comme le syndrome métabolique et l’obésité, le microbiote intestinal est également accusé de fournir le stimulus d’une réponse inflammatoire basale soutenue.

On a récemment décrit l’existence de l’axe cerveau-intestin, qui relie le système nerveux central au microbiote intestinal par l’intermédiaire du nerf vague, du système parasympathique, des métabolites bactériens, qui peuvent avoir des actions semblables à celles des neurotransmetteurs, et du système endocrinien associé au tube digestif. Ainsi, outre les maladies classiquement liées à des altérations du microbiote, telles que l’obésité, le diabète de type 2, les maladies inflammatoires de l’intestin et les allergies, d’autres maladies du système nerveux central, telles que l’autisme, l’anxiété, la dépression et la dépendance à l’alcool, ont également été récemment associées.

Il est désormais admis que pour atteindre un état de santé général, il est nécessaire que notre microbiote, en particulier celui associé au tractus gastro-intestinal, soit également sain. Les principaux indicateurs de la santé du microbiote sont sa richesse (nombre de micro-organismes) et sa biodiversité (nombre d’espèces). Ces deux paramètres sont évalués à l’aide d’indices de biodiversité de type alpha, tels que l’indice de Shannon (qui reflète l’hétérogénéité d’une communauté en fonction du nombre d’espèces présentes et de leur abondance relative), et l’indice de Chao (abondance et représentation de chaque espèce dans tous les échantillons).

De nombreuses associations ont été publiées entre des états pathologiques et des altérations du microbiote, soit par la présence ou l’augmentation de certains genres, soit à l’inverse, l’absence ou la diminution de leur concentration. Afin d’évaluer et de comparer le microbiote d’un patient avec celui d’un sujet sain, des méthodes informatiques d’ordonnancement sont utilisées, comme la méthode de clustering, ou la réduction des dimensions des matrices de distance qui définissent l’ensemble des échantillons de chaque étude. Une analyse en composantes principales peut également être effectuée, ce qui permet d’ajouter d’autres variables cliniques.

Transfert de matières fécales

Actuellement, la seule indication du transfert fécal est la diarrhée récurrente à C. difficile, où l’objectif est de restaurer écologiquement la diversité bactérienne et la dysbiose causées par la diarrhée et l’agent pathogène. Les premières lignes directrices recommandaient le transfert à la troisième récidive ; toutefois, une révision récente recommande le transfert après le deuxième épisode de diarrhée. Dans les cas où le transfert ne donne pas de résultats immédiats, un deuxième transfert peut être effectué dans les mêmes conditions, et s’il échoue à nouveau, il peut être effectué à nouveau, mais en utilisant un donneur différent.

Il existe d’autres maladies pour lesquelles le transfert fécal présente un grand potentiel thérapeutique : les maladies inflammatoires de l’intestin, l’obésité, le syndrome métabolique, les maladies auto-immunes, les allergies, le syndrome de fatigue chronique et certaines maladies neuropsychiatriques. Pour toutes ces maladies, des études sur le transfert fécal ont été publiées, bien que les résultats n’aient pas été aussi concluants que pour la diarrhée à C. difficile. Parmi celles-ci, la colite ulcéreuse présente les meilleurs résultats cliniques, bien que le succès semble dépendre du donneur pour chaque patient.

Les effets secondaires de cette procédure sont généralement peu nombreux et mineurs. Un examen récent de 50 publications relatives au transfert de matières fécales a montré qu’un grand nombre de patients ont subi des effets indésirables . Nombre de ces effets secondaires sont associés à la voie d’administration de la perfusion, la coloscopie étant la voie la plus sûre. Des cas de décès dus à une pneumonie par aspiration ont été signalés, presque toujours liés à l’administration d’une sonde nasogastrique. Cependant, toutes les études indiquent que les effets indésirables à long terme du transfert de selles ne sont pas connus à l’heure actuelle. L’absence de maladies transmissibles chez le donneur est une condition essentielle, et les directives internationales énumèrent les conditions qui doivent être écartées avant d’accepter un donneur. Fondamentalement, le donneur est sélectionné de la même manière que pour toute transplantation d’organe. Une autre application possible du transfert de matières fécales est la décontamination intestinale des patients colonisés par des bactéries multirésistantes aux antibiotiques. Jusqu’à présent, l’éradication des entérocoques résistants à la vancomycine, des staphylocoques résistants à la méthicilline et des Klebsiella spp. productrices de carbapénémase a été décrite.

Sélection de l’échantillon

Comme décrit ci-dessus, chaque zone de notre corps abrite son propre microbiote particulier et, par conséquent, l’échantillon dépendra de la zone à étudier. La grande majorité des études se concentrent sur le microbiote intestinal, car il est le plus nombreux et a le plus grand impact sur notre état de santé. Pour l’étude de cette communauté, l’échantillon le plus couramment utilisé est celui des fèces, car il est facile à obtenir de manière non invasive. Les inconvénients des fèces sont qu’elles ne représentent pas la totalité du microbiote attaché à l’épithélium intestinal et que les bactéries des voies intestinales supérieures peuvent être totalement dégradées, empêchant leur détection correcte. Dans certaines conditions, comme les maladies inflammatoires de l’intestin, des biopsies obtenues lors d’une endoscopie de routine peuvent être utilisées. La biopsie présente l’avantage d’être un échantillon plus réel, dont le prélèvement et la conservation sont plus standardisés, mais elle a aussi les inconvénients d’être invasive, de ne recueillir le microbiote qu’à partir d’un point précis et que les lavements utilisés pour préparer le patient à la coloscopie peuvent en modifier la composition. Pour ces raisons, le prélèvement le plus couramment utilisé est celui des selles au lieu de la biopsie. Une autre option consiste à utiliser les exsudats rectaux, qui reproduisent des profils de microbiote similaires à ceux que l’on trouve dans les fèces. Cet échantillon est facile à obtenir et peut être stocké immédiatement après le prélèvement au centre. En outre, cet échantillon est actuellement utilisé dans tous les hôpitaux pour l’étude des patients présentant des bactéries multirésistantes aux antibiotiques avec de bons résultats, bien que la représentation complète du microbiote ne soit pas assurée.

Collecte, stockage et transport

Si l’échantillon est constitué de selles, les recommandations sont de le prélever comme pour une culture de selles et de le congeler immédiatement à -80°C, bien que des températures plus élevées (jusqu’à -20°C) soient également acceptables. La congélation empêche les changements possibles dans les communautés microbiennes jusqu’à ce que l’extraction des acides nucléiques puisse être effectuée. La congélation rapide est particulièrement importante si l’ARN doit être extrait, car il se dégrade facilement à température ambiante. Les écouvillons rectaux peuvent être conservés jusqu’à 2h à température ambiante dans un tampon stabilisant sans impact sur la composition du microbiote.

Dans le cas où l’échantillon de choix est constitué de fèces, la procédure la plus courante est que les patients les collectent à domicile, les conservent au réfrigérateur (4°C) ou au congélateur (-20°C) et les livrent le plus rapidement possible au centre où ils doivent être traités. Certains facteurs peuvent modifier les résultats finaux, tels que la contamination pendant le prélèvement, le délai de congélation, la congélation à des températures pas trop basses ou la décongélation pendant le transport vers le laboratoire. Lorsque l’échantillon reste à température ambiante, la composition de son microbiote peut être altérée et une congélation immédiate est recommandée. Une autre possibilité, qui a été étudiée avec de bons résultats, consiste à congeler l’échantillon dans les 15 minutes suivant la défécation et à le conserver jusqu’à 3 jours au congélateur à la maison.

Selon chaque centre, en fonction du type d’échantillon et du temps de conservation jusqu’au traitement, il sera nécessaire de choisir la méthode la plus appropriée en fonction de différents critères, notamment le coût, la disponibilité, la difficulté d’utilisation, le temps nécessaire à la manipulation et la compatibilité avec les autres méthodes de diagnostic à utiliser sur le même échantillon15.

Traitement des échantillons : extraction des acides nucléiques

Différents micro-environnements avec des variations dans la composition de leur microbiote peuvent exister au sein d’un même échantillon, et il est donc très important de réaliser une bonne homogénéisation mécanique avant de commencer le processus d’extraction. Il est également très important de dissoudre complètement l’aliquote de l’échantillon à traiter, généralement 0,5 g de fèces dans 5 ml d’eau, par vortex ou en utilisant des billes de verre.

L’étape la plus critique de tout le processus est sans aucun doute l’extraction et la purification des acides nucléiques, généralement l’ADN, car il faut obtenir une bonne quantité et une bonne qualité sans entraîner de substances qui pourraient inhiber les réactions PCR ultérieures. Pour l’extraction, il existe différents protocoles commerciaux et manuels, qui donnent généralement de bons résultats.

Méthode de séquençage

Grâce aux progrès technologiques en matière de séquençage de masse, de nouvelles méthodes ont été mises au point qui permettent de séquencer directement l’ADN fragmenté ou amplifié sans avoir recours au clonage. Ces méthodes de séquençage sont connues sous le nom de méthodes de deuxième génération et sont regroupées sous la définition de séquençage de nouvelle génération. Les méthodes de deuxième génération présentent de nombreux avantages, notamment un coût moindre, une réduction du temps de préparation des bibliothèques et du processus de séquençage, une qualité de données acceptable et, surtout, la génération d’un grand nombre de séquences.

Le séquençage de masse avec les méthodes de deuxième génération nécessite une étape préalable d’amplification par PCR qui peut être trompeuse, notamment en surestimant les populations majoritaires. Néanmoins, ces techniques sont actuellement la norme pour l’étude des communautés microbiennes, notamment le microbiote humain. Les méthodes de séquençage de deuxième génération comprennent celles basées sur la technologie pionnière 454 de Roche, qui n’est plus sur le marché. Les technologies les plus courantes actuellement disponibles sont Solexa, commercialisée par Illumina, et Ion Torrent, commercialisée par Thermo Fisher.

Afin de pouvoir comparer les résultats de différentes études, il est important de connaître les différentes méthodologies et leurs biais. Le processus PCR a des limites, car il amplifie toujours les plus abondants, et les populations minoritaires sont négligées. Il est également important de choisir les bonnes amorces à utiliser. Les amorces les plus couramment utilisées amplifient la région V3-V4 du gène de l’ADNr 16S, et ont été choisies sur la base de leur « universalité » pour la plupart des espèces bactériennes, bien qu’il ait été récemment signalé que certaines espèces de bifidobactéries et de bactéries lactiques n’amplifient pas avec ces amorces en raison d’échecs d’hybridation.

L’étude du microbiote basée sur la taxonomie du gène de l’ARNr 16S quantifie l’abondance relative de chaque phylum, famille ou genre. Cette méthode présente toutefois un inconvénient majeur, car ce gène a un nombre de copies différent dans chaque genre ou espèce. Par exemple, Mycobacterium tuberculosis possède une seule copie du gène, Helicobacter pylori en possède 2, Staphylococcus en possède 7 et, enfin, Clostridium beijerinckii en possède 14.

Malgré les biais possibles et les limites techniques qui existent dans le séquençage de masse, ces approches moléculaires sont des outils très puissants, qui sont souvent reproductibles et permettent de déterminer les changements structurels dans les communautés microbiennes. Pour toutes ces raisons, le séquençage de deuxième génération est considéré comme la meilleure option pour étudier le microbiome humain.

La troisième génération de séquenceurs est également déjà sur le marché et plusieurs appareils sont en cours de développement. Les principales avancées qu’ils apportent sont le séquençage direct sans étape d’amplification par PCR et la longueur des séquences obtenues, qui peut atteindre plusieurs kilobases. Cependant, l’un de leurs inconvénients est qu’ils doivent améliorer la qualité des séquences obtenues. Ces méthodes de troisième génération comprennent le nouveau système Sequel de Pacific Biosciences (PacBio) et le MinION d’Oxford Nanopore.

Stratégies de caractérisation du microbiote

1) Métataxonomie : il s’agit de la stratégie la plus largement utilisée pour caractériser la composition et la quantité relative des communautés microbiennes, ainsi que leur évolution en fonction du temps ou d’autres variables cliniques. À partir d’un échantillon de selles dont on extrait l’ADN total, le gène de l’ADNr 16S est amplifié avec des amorces universelles, puis les amplicons sont massivement séquencés. Chaque séquence est assignée à un groupe taxonomique en recherchant dans les bases de données publiques telles que le Ribosomal Database Project, puis les résultats sont analysés avec des outils bioinformatiques, d’abord pour valider la qualité (identité≥98%) et la longueur (≥200bp) des séquences. L’ordre habituel de l’analyse bioinformatique comprend : a) le contrôle de la qualité des séquences ; b) l’élimination des séquences chimériques ; c) le regroupement des séquences en fonction des caractéristiques de similarité et de chevauchement ; d) l’attribution taxonomique ; et e) l’analyse statistique pour déterminer les différences significatives.

En général, le processus complet de séquençage de masse est réalisé par des services de séquençage, en raison de la haute spécialisation technique requise et de la disponibilité limitée des appareils nécessaires à cette méthodologie. Ces unités offrent les connaissances et les compétences nécessaires pour réaliser la construction et le séquençage de bibliothèques selon les normes de chaque technologie choisie. Bien que le traitement final des données soit généralement effectué par un expert en bioinformatique, il est toujours nécessaire d’attribuer une signification biologique et microbiologique aux résultats .

2) Métataxonomie de la fraction active. Les études de métataxonomie fournissent des informations sur la composition du microbiote sans faire de distinction entre les bactéries vivantes et mortes, dormantes ou inactives. Les informations fonctionnelles des bactéries sont également importantes, car elles peuvent affecter directement ou indirectement notre santé. Afin d’identifier les bactéries actives, il est nécessaire d’extraire l’ARN de l’échantillon, de le transformer en ADNc par rétrotranscription et enfin de le séquencer. De cette façon, seules les bactéries qui se divisent sont identifiées. Les techniques et technologies utilisées pour cette étude sont les mêmes que pour la métataxonomie, sauf que dans ce cas, le matériel de départ est la molécule d’ARNr 16S.

3) Métagénomique. Cette approche est basée sur le séquençage massif de l’ADN ou de l’ARN (ou ADNc) pour étudier comment les altérations de la composition microbienne influencent le contenu et l’expression des gènes. Cette méthode, mise au point dans les années 1980 et 1990, est connue sous le nom de séquençage par injection et permet de lire les séquences de fragments d’ADN ou d’ARN sans amplification préalable. Il s’agit d’une méthode qui nécessite davantage de calculs des données, ce qui tend à rendre le processus plus coûteux. L’ensemble de tous ces fragments est considéré comme représentatif de l’ensemble des génomes bactériens présents dans le microbiote d’origine. Le séquençage du métagénome permet d’éviter le biais important introduit par le processus de PCR, puisque les fragments obtenus sont choisis au hasard parmi le nombre total de génomes présents dans l’échantillon original .

4) Métabolomique. Cette stratégie permet d’identifier et de caractériser les métabolites d’un point de vue fonctionnel19 . La détermination qualitative et quantitative des métabolites est considérée comme l’un des meilleurs marqueurs de l’activité microbienne, car ils sont le produit final d’une réaction métabolique, quels que soient les micro-organismes ou le nombre d’enzymes impliqués. L’analyse métabolique d’un échantillon tel que les fèces est très compliquée car il contient non seulement les produits métaboliques des micro-organismes et des cellules épithéliales, mais reçoit également un flux constant de substances avec l’apport alimentaire. Du point de vue de la chimie analytique, deux types d’outils sont nécessaires pour l’analyse du métabolome : la résonance magnétique nucléaire et la spectrométrie de masse. Par ailleurs, quelles que soient les techniques, il existe 2 types d’approche métabolomique : ciblée et non ciblée, selon que l’on connaît ou non la nature du métabolite à identifier et/ou à quantifier.

Les métabolites bactériens les plus étudiés dans les fèces sont les acides gras à chaîne courte (AGCC), issus de la fermentation bactérienne des glucides complexes alimentaires (fibres et amidon). Les principaux AGCS détectés dans les fèces sont l’acide acétique, l’acide propionique et l’acide butyrique (>90% de tous les AGCS), mais il existe également des acides ramifiés, l’acide isobutyrique et l’acide isovalérique, qui sont minoritaires (environ 5% du total) et proviennent principalement du métabolisme des protéines et des acides aminés et ont été moins étudiés en général que les principaux AGCS.

La plupart des AGCS produits dans le côlon sont absorbés dans la muqueuse colique par diffusion et par des transporteurs spécifiques. Alors que l’acide butyrique est presque entièrement consommé par l’épithélium colique et constitue la principale source d’énergie des colonocytes, les acides acétique et propionique passent dans la circulation portale et sont utilisés comme précurseurs dans le foie ou les tissus périphériques pour la gluconéogenèse et la lipogenèse hépatiques. Les AGCS sont d’une grande importance dans la physiologie et la nutrition du tractus gastro-intestinal et présentent des propriétés anti-inflammatoires et anticarcinogènes. L’acide butyrique a été lié à l’inversion des cellules néoplasiques et pourrait être impliqué dans la prévention des processus cancéreux.

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